Resumo: O fungo Sclerotinia sclerotiorum, agente causal do mofo-branco, encontra-se disseminado em todo o mundo. A doença é considerada uma das principais da cultura da soja e do feijão no Brasil. O patógeno S. sclerotiorum é disseminado pelas sementes de soja e feijão tanto na forma de escleródios como na forma de micélio dormente no interior das sementes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre diferentes potenciais de S. sclerotiorum nas sementes de soja e feijão e o desempenho dessas sementes, bem como verificar a localização e a quantificação do inóculo nas sementes inoculadas pela técnica de PCR em tempo real (qPCR), validando o termo potencial de inóculo. Sementes de soja e feijão foram inoculadas com o fungo pelo método do condicionamento osmótico baseado na exposição das sementes ao fungo pelos períodos de 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. A análise molecular foi realizada por meio de qPCR em sementes inteiras e dissecadas em tegumento, cotilédone e eixo embrionário. Os resultados demonstraram que os efeitos de S. sclerotiorum na germinação e vigor das sementes foram progressivos e proporcionais aos aumentos dos potenciais de inóculo, visto que no maior potencial (P96) foi possível observar danos mais severos nas sementes e, consequentemente, nas plantas emergidas. O inóculo do patógeno foi encontrado em todas as partes das sementes avaliadas, mesmo no seu menor potencial de inóculo (P24), apresentando uma concentração de DNA crescente, onde o tegumento obteve maior quantidade de DNA que o embrião quando comparadas.

Abstract: The fungus Sclerotinia sclerotiorum, the causal agent of white mold, is widespread throughout the world. The disease is considered to be one of the major diseases of soybean and bean crops in Brazil. The pathogen S. sclerotiorum is spread by soybean and bean seeds both in the form of sclerotia and dormant mycelium inside the seeds. The objective of this work was to evaluate the relationship between different potentials of S. sclerotiorum in soybean and bean seeds and the performance of these seeds, as well as to verify the localization and quantification of the inoculum of the pathogen in the seeds inoculated by Real-time PCR (qPCR), validating the term inoculum potential. Soybean and bean seeds were inoculated with the fungus by the osmotic conditioning method based on the exposure of the seeds to the fungus for periods of 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h. Molecular analysis was carried out by means of qPCR in whole seeds and dissected in the integument, cotyledon and embryonic axis. The results showed that the effects of S. sclerotiorum on seed germination and vigor were progressive and proportional to the increases in inoculum potentials, since there was more severe damage to the seeds and consequently to the emerged plants at the highest potential (P96). The inoculum of the pathogen was found in all parts of the evaluated seeds, even at its lowest inoculum potential (P24), with an increasing DNA concentration, and the integument obtained a greater amount of DNA than the embryo, in comparison.

Resumo: A ramulose do algodão (Gossypium hirsutum), causada por Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides (Cgc), é uma doença importante que afeta as plantações de algodão no Brasil. De acordo com as autoridades fitossanitárias brasileiras, esse organismo tem sido considerado uma praga quarentenária não regulamentada, o que faz com que ela seja objeto de padronização em programas de certificação de sementes. Neste trabalho, um par de primer foi selecionado com base na análise de um alinhamento múltiplo de sequências do gene que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase a partir de Cgc, C. gossypii e isolados de referência representantes de outras espécies do complexo C. gloeosporioides. Uma única região conservada de Cgc foi utilizada para desenhar um par de primer específico de 140 pb. A especificidade dos primers foi confirmada pela utilização de outros fungos isolados de semente algodão. Os primers produziram uma banda detectável de DNA de Cgc em todos os potenciais de inóculo artificialmente inoculados pela técnica de restrição hídrica. Os primers desenvolvidos representam, portanto, um meio confiável e rápido para diagnosticar Cgc em amostras de sementes de algodão.

Abstract: Cotton Ramulosis (Gossypium hirsutum) is an important disease affecting cotton plantations in Brazil, and its causal agent, Colletotrichum gossypiivar.cephalosporioides(Cgc), according to the Brazilian phytosanitary authority, was considered a regulated non quarantine pest. It makes this microorganism subject to standardization in seed certification programs. The current seed health testing for detecting that pathogen in seed samples does not provide reliable results for routine analysis. On this paper, attempts were made to design specific primers for detection of Cgc associated with cotton seed. Two primer sets were selected based on the analysis of a multiple alignment of gene’s sequence encoding the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Cgc, C. gossypii and reference strains of the C. gloeosporioides species complex. The conserved sites unique to Cgc strains were used to design specific fragment of 140 bp. The primer specificity was confirmed by using other fungi. The primers produced a detectable band of target DNA of Cgc in all inoculum potentials of the pathogen artificially inoculated by the water restriction technique. The developed primer pair represents, therefore, a reliable and rapid mean to diagnose the Ramulosis agent in cotton seed.

Resumo: A antracnose do feijoeiro, causada por Colletotrichum lindemuthianum, é uma das principais doenças que ocorre no feijoeiro e as perdas podem chegar a 100%. A transmissão deste patógeno de sementes para plântulas/plantas pode variar de acordo com as condições ambientais e nível de inóculo, dentre outros fatores. O objetivo deste trabalho foi quantificar a taxa de transmissão de C. lindemuthianum, raça 65, a partir de sementes de feijão infectadas. A inoculação das sementes foi realizada pela técnica de condicionamento hídrico com o intuito de se obter sementes com diferentes potenciais de inóculo, em função do tempo de exposição das sementes com o fungo em cultura pura, sendo os potenciais denominados: P0, P36, P72, P108 e P144. Sementes não inoculadas e inoculadas foram semeadas individualmente e mantidas em câmaras de crescimento vegetal sob duas temperaturas de crescimento, 20 e 26 °C pelo período de 28 dias. Observou-se que, tanto em plantas assintomáticas, quanto nas sintomáticas, houve transmissão do patógeno. A maior taxa de transmissão total (92%) ocorreu nas plantas originadas a partir de sementes expostas por 144 horas ao fungo e a 20 °C.

Abstract: Anthracnose, caused by Colletotrichum lindemuthianum, is one of the main diseases affecting common bean in Brazil, and field losses can reach 100%. Transmission of this pathogen from seeds to seedlings/plants may vary according to environmental conditions and initial inoculum levels, among other factors. The aim of this study was to quantify the transmission rate of C. lindemuthianum, race 65, from infected bean seeds to seedlings/plants under controlled conditions. Seed inoculation was performed by the water conditioning technique in order to obtain seeds with different inoculum potentials as a result of the exposure time of the seeds to the fungus in pure culture, with the potentials denominated P0, P36, P72, P108, and P144. Inoculated and non-inoculated seeds were individually sown and kept in growth chambers under two temperatures, 20 and 26 °C, for a period of 28 days. There was transmission of the pathogen in both asymptomatic and symptomatic plants. The highest total transmission rate (92%) occurred in plants originating from seeds exposed for 144 hours to the fungus at 20 °C.

ABSTRACT: The incorporation of organic matter to the soil not only improves nutrient content, but also reduces the survival of Stenocarpella, the causal agent of stalk rot, Diplodia ear rot, and grey leaf spot, in maize stubble. We evaluated the effect of organic waste incorporation on Stenocarpella survival in maize stalks, the activity of suppressiveness-related enzymes, and nutrient contents. We conducted the assays in the municipalities of Lavras and Sete Lagoas, Minas Gerais State, Brazil. Maize stalks infested with Stenocarpella were kept in field conditions for three months after poultry litter, swine manure, fish hydrolysate, compost sewage sludge, and urea application. Infested stalks, without residue amendment, were kept on surface or incorporated into the soil, representing negative and positive controls. Stenocarpella concentration in stalks was assessed using qPCR expressed as cycle threshold number. Sewage sludge, buried stalks, and stalks retained on the surface showed reduction of pathogen inoculum. Swine manure and urea did not reduce the quantity of DNA. In the experiment conducted in Lavras, poultry litter stimulated β-glucosidase, urease and hydrolysis of fluorescein diacetate activities when compared to the negative control. Sewage sludge, poultry litter, and swine manure increased Ca in the soil by 44 %, 38 % and 36 %, respectively, in the experiment conducted in Lavras. Poultry litter increased Ntotal three months after application. The results indicate that organic wastes are promising in improving nutrient content, activity of hydrolysis-related enzymes, but Stenocarpella inoculum dynamics should be taken into consideration when deciding on the specific organic amendment.

Resumo: Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro, tendo a semente como uma forma de disseminação. O uso de sementes de feijão livres do patógeno é uma das estratégias de manejo, e o uso de técnicas de detecção precisas e rápidas torna-se indispensável para a análise sanitária prévia de sementes. Neste estudo, as técnicas de PCR convencional (cPCR) e PCR em tempo real (qPCR) foram utilizadas para a detecção e quantificação de C. lindemuthianum em amostras de sementes de feijão. Para isso, sementes foram inoculadas por meio de sua exposição às colônias do fungo por tempos variados, 0, 36, 72, 108, e 144 horas, cada período correspondendo a um potencial de inóculo, P0, P36, P72, P108 e P144. As sementes inoculadas foram misturadas com sementes sadias, obtendo-se incidências de 0,25% 0,50%, 1%, 10% e 100% de sementes para cada potencial de inóculo em amostras de 400 sementes. Tanto a cPRC como a qPCR foram eficazes na detecção do fungo. A partir das amostras de sementes com 10% de incidência e com P36, foi possível detectar o fungo por cPCR. Pela técnica de qPCR o patógeno foi detectado em amostras a partir da incidência de 0,25% no menor potencial de inóculo P36.

Abstract: Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of anthracnose in common bean, and infected seeds are the most typical propagation form of the disease. Thus, using common bean seeds free of C. lindemuthianum is crucial to managing this pest, as well as employing fast and accurate detection techniques to ensure high seed quality. In this study, both conventional and quantitative PCR techniques (cPCR and qPCR) were used for the detection and quantification of C. lindemuthianum in samples of common bean seeds. For that, seeds were inoculated by exposing them to fungal colonies for different periods of time, 0 h, 36 h, 72 h, 108 h and 144 h, each period corresponding to an inoculum potential. Then, they were mixed with healthy seeds, so incidences of 0.25%, 0.50%, 1%, 10%, and 100% of seeds with different inoculum potentials were obtained, in samples of 400 seeds. Both cPRC and qPCR techniques were effective in detecting the fungus. With the cPCR method, the highest sensitivity was recorded in those samples with 10% inoculated seeds with inoculum potential P36. On the other hand, with the qPCR technique, the highest sensitivity in detecting the fungus was observed in samples with 0.25% inoculated seeds with inoculum potential P36.

Resumo: Diante do que já se conhece em sanidade de sementes e tendo-se em mãos métodos moleculares para a detecção dos fungos Stenocarpella maydis, Stenocarpella macrospora em sementes de milho, Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides em algodão e Corynespora cassiicola em soja, objetivou-se neste estudo avaliar o vigor das sementes em função dos diferentes potenciais de inóculo. Os isolados dos fungos foram inoculados nas sementes por meio da técnica de restrição hídrica pela qual se obtém diferentes potenciais de inóculo, que foram representados por P0, P24, P48 e P96 e P0, P36, P108 e P144, que correspondem à exposição das sementes aos períodos de tempo de 0, 24, 48, 96 horas (milho e algodão) e nos tempos 0, 36, 108 e 144 horas (soja), respectivamente. As sementes foram submetidas aos testes de germinação, condutividade elétrica, sanidade e qPCR. Pelo blotter test, na maioria dos patossistemas, houve maior incidência do fungo com o aumento do potencial de inóculo. Foi observada uma queda na porcentagem de germinação de todas as espécies com o aumento do potencial de inóculo, assim como maior degradação das membranas das sementes. A qPCR confirmou que nas sementes mais prejudicadas havia maior quantidade de inóculo dos patógenos.

Abstract: Given what is already known in regard to seed health and the availability of molecular methods for detection of the pathogens Stenocarpella maydis and Stenocarpella macrospora in maize seeds, Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides in cotton seeds, and Corynespora cassiicola in soybean seeds, the aim of this study was to evaluate seed vigor according to different inoculum potentials. The fungus isolates were inoculated on seeds by the technique of water restriction, through which different inoculum potentials are obtained, corresponding to times of seed exposure of 0, 24, 48, and 96 hours for maize and cotton seeds, and 0, 36, 108, and 144 hours for soybean seeds. The seeds were subjected to germination, electrical conductivity, health, and qPCR tests. Results of the blotter test showed that in most pathosystems, there was a higher incidence of the fungi with an increase in inoculum potential. A decrease in germination percentage was observed in all species as inoculum potential increased, as well as further degradation of seed membranes. The qPCR test confirmed that the most damaged seeds in the tests had higher presence of the pathogens.

Resumo O fungo Corynespora cassiicola, agente causal da mancha alvo em soja, pode ser transmitido por sementes de soja e a partir daí causar danos severos. A diagnose precoce desta doença pode ser realizada por meio de testes de sementes, cujo conhecimento é insuficiente. Por esta razão e pelo aumento da área de soja atacada pela referida doença no Brasil, estudos mais aprofundados são necessários. Neste trabalho, o objetivo foi avaliar o uso da técnica PCR convencional na detecção de C. cassiicola em amostras de sementes de soja. Os primers GA4-F/GA4-R, relatados na literatura, foram testados para verificar a sua especificidade e sensibilidade para detecção de C. cassiicola em cultura pura e em sementes de soja. Foram utilizadas amostras de sementes, inoculadas e não inoculadas, com diferentes níveis de incidência, de 100%, 10%, 1%, 0,5%, 0,25% e 0%, por potenciais de inóculo preestabelecidos, P0, P1, P2 e P3. A detecção de C. cassiicola no potencial de inóculo P1, foi observada em amostras com níveis de incidência de 10% a 100%. No potencial P3, a detecção do patógeno foi bem-sucedida em amostras com nível mínimo de 0,25%.

Abstract The fungus Corynespora cassiicola, causal agent of target spot in soybeans, can be transmitted by soybean seeds and as of that point cause severe damage. This disease may be diagnosed at an early stage by seed testing, but knowledge in this area is insufficient. Because of that and increased attack by the disease in soybean areas in Brazil, further studies are required. The aim of this study was to evaluate the use of conventional PCR in detecting C. cassiicola in soybean seeds. The GA4-F/GA4-R primers described in the literature were tested for their specificity and sensitivity for detection of C. cassiicola in pure culture and in soybean seeds. Uninoculated and inoculated seed samples were used with different incidence levels - 100%, 10%, 1%, 0.5%, 0.25%, and 0% of preestablished inoculum potentials, P0, P1, P2, and P3. Detection of C. cassiicola in P1 inoculum potential was observed in samples with incidence levels of 10% to 100%. In the P3 potential, detection of the pathogen was successful in samples at the low level of 0.25%.

RESUMO tenocarpella maydis é um dos principais fungos que se associam às sementes de milho, sendo um dos agentes causais da podridão do colmo e da espiga, que ocasiona perdas consideráveis em regiões produtoras desta cultura no Brasil. O referido organismo tem sido enquadrado como uma praga sujeita a padronização sanitária em programas de certificação de sementes vigentes no país. O objetivo nesse trabalho foi avaliar a taxa de transmissão do referido fungo a partir de sementes de milho infectadas. As sementes foram inoculadas com dois isolados pelo método de condicionamento fisiológico no qual as sementes são mantidas em contato com colônias do fungo por 24 (P1), 48 (P2), 72 (P3) e 96 (P4) horas. Foram utilizadas duas cultivares, uma suscetível (C1) e outra moderadamente resistente (C2) e o ensaio conduzido em duas temperaturas (20 e 25 ºC). As sementes inoculadas foram distribuídas individualmente em copos plásticos contendo substrato. As plantas foram avaliadas diariamente quanto ao estande e aparecimento de sintomas em pós-emergência. Com base em sementes mortas, as taxas de transmissão alcançaram o percentual máximo de 90,5% para o potencial de inóculo P4, sendo esta taxa mais alta do que as alcançadas pelas taxas de transmissão para infecção sintomática e assintomática em plantas emergidas. Em relação à taxa de transmissão total, observou-se a transmissão do patógeno em todos os potenciais de inóculo, variando estes valores entre 25% para C2 no potencial P1 sob temperatura de 20 ºC e 93% para C2 no potencial P3 sob temperatura de 25 ºC.

ABSTRACT tenocarpella maydis is one of the main fungi associated with maize seeds, being a causative agent of stalk and ear rot, a disease which causes considerable losses for crop-producing regions in Brazil. The organism is considered to be a pest, subject to sanitary standardisation in current programs of seed certification in the country. The aim of this study was to evaluate the transmission rate of the fungus from infected maize seeds. Seeds were inoculated with two isolates using a method of physiological conditioning, in which the seeds are kept in contact with colonies of the fungus for 24 (P1), 48 (P2), 72 (P3) and 96 (P4) hours. Two cultivars were used, one susceptible (C1) and one moderately resistant (C2), and the trial carried out at two temperatures (20 ºC and 25 ºC). The inoculated seeds were distributed individually into plastic cups containing substrate. The plants were evaluated daily for stand and the appearance of post-emergent symptoms. Based on the number of dead seeds, transmission rates reached a maximum of 90.5% at the P4 inoculum potential, this rate being greater than transmission rates achieved for symptomatic and asymptomatic infection in emerged plants. For the total transmission rate, transmission of the pathogen was seen at all inoculum potentials; these values varying from 25% for cultivar C2 at potential P1 and a temperature of 20 ºC, to 93% for cultivar C2 at potential P3 and a temperature of 25 ºC.

Stenocarpella maydis e Stenocarpella macrospora, espécies causadoras de manchas foliares, podridões em plantas e grãos ardidos de milho, podem ser transportadas e dispersas para áreas produtoras através das sementes. O objetivo foi transformar isolados de espécies de Stenocarpella com GFP e DsRed e correlacionar diferentes potenciais de inóculo com o efeito causado pela presença desses patógenos nos tecidos de sementes de milho. Os isolados foram transformados por meio da introdução dos genes nos seus núcleos, empregando a técnica de transformação de protoplastos. Sementes foram inoculadas pelo método de condicionamento osmótico com isolados transformados e não transformados, com diferentes tempos de exposição das sementes a estes isolados, caracterizando os potenciais de inóculo, P1 (24 h), P2 (48 h), P3 (72 h) e P4 (96 h). As sementes inoculadas, com isolados transformados expressando GFP e DsRed, de ambas as espécies, elucidaram por meio das intensidades das fluorescências emitidas, a capacidade desses organismos de causarem infecção e colonização em diferentes potenciais de inóculo, tendo P3 e P4, provocado as maiores intensidades de fluorescência pelas colonizações dos patógenos. Um abrangente e abundante crescimento micelial nas estruturas colonizadas das sementes foi observado nos potenciais P3 e P4, por meio da MEV.

Stenocarpella maydis and Stenocarpella macrospora species causing leaf spots and stem and ear rots, can be transported and disseminated between cultivating areas through seeds. The objective was to transform isolates of species of Stenocarpella with GFP and DsRed and to correlate different inoculum potentials with the effect caused by the presence of these pathogens in the tissues of maize seeds. The isolates were transformed with introduction of the genes in their nuclei, employing the technique of protoplast transformation. Seeds were inoculated by osmotic conditioning method with transformed and not transformed isolates, with different periods of exposition of seeds to those isolates, characterizing the inoculum potentials, P1 (24 h), P2 (48 h), P3 (72 h) and P4 (96 h). The seeds inoculated with isolates expressing GFP and DsRed in both species elucidated by means of the intensities of the emitted fluorescence, the ability of those organisms to cause infection and colonization in different inoculum potentials. The potentials P3 and P4 caused the highest levels of emitted fluorescence for the colonization by both pathogens. A comprehensive and abundant mycelial growth in the colonized seed structures were well visualized at potential P3 and P4 by means of SEM.

Sementes de milho infectadas por Stenocarpella macrospora podem ocasionar podridão do colmo e da espiga e manchas foliares. A transmissão deste patógeno por meio de sementes pode variar de acordo com a cultivar, as condições climáticas e a virulência do patógeno, entre outros fatores. O objetivo foi avaliar a taxa de transmissão de S. macrospora a partir de sementes das cultivares de milho C1-RB9308YG e C2-RB9108, infectadas artificialmente e cultivadas sob duas temperaturas (20 ºC e 25 ºC). A inoculação das sementes foi realizada pelo método de condicionamento osmótico, por 24 (potencial de inóculo - P1), 48 (P2), 72 (P3) e 96 (P4) horas. Após a inoculação, 25 sementes foram distribuídas, individualmente, em copos plásticos contendo substrato, com 4 repetições por tratamento. Ao final de 28 dias de avaliações diárias, todas as plantas foram analisadas para a presença do patógeno por métodos biológicos e algumas, amostradas ao acaso, por Bio-PCR. As porcentagens máximas de morte em pré-emergência de sementes/plântulas foram de 74,5% e 82,5%, para P3 e P4, respectivamente. A maior taxa de transmissão total do referido patógeno neste estudo foi de 85,8%, ocorrida no potencial de inóculo mais elevado (P4) em sementes da cultivar C1, cultivadas na temperatura de 20 ºC.

Maize seeds infected by Stenocarpella macrospora can cause stalk and ear rot and leaf spot. Transmission of this pathogen through seeds may vary according to the cultivar, climatic conditions, and virulence of the pathogen among other factors. The aim of this study was to assess the transmission rate of S. macrospora from seeds of the maize cultivars C1-RB9308YG and C2-RB9108 using artificially infected seeds grown under two temperatures (20 ºC and 25 ºC). Seeds were inoculated by the osmotic conditioning method for 24 h (inoculum potential - P1), 48 h (P2), 72 h (P3) and 96 h (P4). After inoculation, 25 seeds were distributed individually in plastic cups with substrate, with 4 replicates per treatment. At the end of twenty-eight days of daily assessments, all plants were analyzed for the presence of the pathogen by biological methods, and some were sampled at random and analyzed Bio-PCR. The maximum percentages of dead seeds/seedlings in pre-emergence were 74.5% and 82.5% for P3 and P4, respectively. The highest total rate of transmission of the pathogen under study was 85.8% for seeds of the cultivar C1 at the highest inoculum potential (P4), grown at the temperature of 20 ºC.

A associação do fungo Stenocarpella maydis com sementes de milho pode comprometer a germinação de sementes e o vigor das plântulas. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos causados por S. maydis sobre a qualidade das sementes de milho bem como no seu desenvolvimento inicial. Para avaliar tais efeitos, sementes de milho cultivares RB9308YG (C1) e RB9108 (C2), foram inoculadas com dois isolados de S. maydis, pelo método de condicionamento osmótico por 24(P1), 48(P2), 72(P3) e 96 horas (P4). O cultivo foi realizado em câmara de crescimento vegetal, sob temperaturas de 20 °C e 25 °C e avaliadas diariamente até 28 dias após a emergência. Avaliou-se a germinação, incidência do fungo, condutividade elétrica, índice de velocidade de emergência (IVE), estande inicial e final e peso de matéria seca. Foi observado que, quanto maior o tempo de exposição das sementes à colônia fúngica, maiores foram os efeitos negativos destes organismos em sementes e plântulas. S. maydis causou redução no vigor das sementes, na velocidade de emergência das plântulas, no estande final e no desenvolvimento inicial das plântulas de milho.

The association of the fungus Stenocarpella maydis with corn seed may cause a reduction of seed germination and vigor of the emerged seedlings. This work was carried out in order to evaluate the effects of S. maydis on corn seed quality as well as on its early development. To evaluate such effects, seeds of cultivars RB9308YG (C1) and RB9108 (C2) were inoculated by the osmotic conditioner technique with two S. maydis isolates for 24(P1), 48(P2), 72(P3) and 96 hours (P4). Plants were grown in a room chamber at 20 °C and 25 °C and daily assessed until 28 days after emergence. Seed germination, incidence of S maydis, electrical conductivity, speed of emergence index (SEI), initial and final seedling population and dry weight of emerged plants, were assessed. The longer the exposition times of the seeds to the fungal colony, the more severe negative effects of the pathogens on seed vigor were observed. S. maydis caused reduced seed vigor in the speed of seedling emergence in the final stand and early development of corn seedlings.